抗原修复法（Antigen Retrieval，AR）

  福尔马林固定时，组织中的许多氨基酸残基在分子内或分子间形成了醛键，使得不少抗原决定簇被封闭。同时，由于甲醛的聚合作用，使蛋白质分子间相互交联形成大分子网络，也导致了抗原决定簇被掩盖，这就使得相当部分的抗原不能与抗体很好的进行反应。在免疫组化染色后的镜下观察中，有发现这样的结果，阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性。为了解决上述存在的问题，更好地暴露出抗原，将其很好地显示出来，目前世界上公认的方法就是必须进行抗原修复。抗原修复（Antigen Retrieval，AR）是指石蜡、冰冻、火棉胶、塑料切片免疫组织化学（IHC）前用胰蛋白酶、尿素、表面活性剂、微波缓冲液和金属盐等，使被掩盖的抗原决定簇或变性的抗原重新暴露或抗原性得到一定程度的恢复过程。抗原修复能最大程度地恢复在制片等过程中损失的抗原性，使原来认为不能在石蜡切片上进行IHC的许多抗体获得了良好的染色结果，成为一种有效的补救措施。

        至今为止，抗原修复有许多种方法，在这些方法中，有的是根据抗体的要求来进行，有的是根据抗原的表达程度来进行。抗原修复的方法选择，关系到组织抗原能否暴露充分，这对免疫组化染色效果有很大影响。因此应当根据不同的抗原特点，采用不同的修复方法。

（一）抗原热修复法

抗原热修复是以高温、高压对常规固定的石蜡切片进行抗原修复或复原的一种非蛋白酶消化以提高抗原抗体阳性检测的一种方法和技术手段。可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。溶液的浓度对修复效果无任何影响，而PH值则影响较大。

1. 微波热修复

切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟阻断内源性过氧(化)物酶，用蒸馏水冲洗。在微波炉里加热抗原修复液（如0.01M，pH6.0的枸橼酸钠缓冲溶液）至沸腾。将组织切片置于切片架中，放入已沸腾缓冲液中，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次加热后，取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。从缓冲液中取出切片，经蒸馏水冲洗二次，之后用PBS（PH7.2-7.4）冲洗两次，每次3分钟，然后进行IHC染色。

2. 高压热修复

将玻片置于金属染色架上，连同修复缓冲液放入高压锅内，使切片位于液面以下，盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。加热至产生喷气，并持续2min，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。加热长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅到压力锅离开热源总时间在5-8分钟，时间过长可能会使染色背景加深。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

3. 煮沸热修复

切片脱蜡至水后，放入盛有修复缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。

（二）酶修复

非加热抗原修复技术包括酶消化、酸水解等方法。目前，主要是酶消化，酶消化是以化学的方法来打断醛键，修复抗原。对某些细胞内抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和细胞间质抗原（如Laminin、CoIV等）则需要用酶消化法处理切片。常用的消化酶为胰蛋白酶和胃蛋白酶。一般说来，胰蛋白酶消化能力较胃蛋白酶弱，主要用于细胞内抗原的消化，胃蛋白酶主要用于细胞间抗原的消化。工作中要认真参照抗体说明书指示进行消化酶的选择，这样针对性更强，标记效果更理想。

a.胰蛋白酶消化法：取0.05g或0.1g胰蛋白酶加入100ml 0.05％或0.1％ PH7.8的无水氯化钙水溶液中，溶解即可；使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟。

b.胃蛋白酶消化法：用0.1mol/L HCL配制成0.4％的胃蛋白酶；消化时间37℃ 30～180min。

c.链霉蛋白酶消化法：将链霉蛋白酶溶于0.5mol/L pH7.4的Tris-HCL中，浓度为0.1％，消化时间37℃ 1～4h。
d.蛋白酶K消化法：用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制成20μg/ml的蛋白酶K，，消化时间37℃ 20～40min。

e.无花果蛋白酶消化法：0.1%浓度，用0.2M pH7.4 PBS配制，消化时间37℃ 30～60min。

f.菠萝蛋白酶消化法：其浓度为0.4%～1％，溶在0.01M，pH7.4 PBS中，37℃消化30～120min。g.尿素消化法：浓度3M，37℃消化5～30min。

胃蛋白酶和菠萝蛋白酶主要用于细胞间质抗原的检测前消化，其余蛋白酶均为细胞内抗原的显示消化。在配制和使用时应考虑到酶激活的最佳pH值，消化温度、浓度和孵育时间。